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PCR引物设计,3款在线软件就能搞定!

日期: 2016-09-26
235

文章来源:解螺旋·医生科研助手

 

·导语·

好的引物会让PCR实验成功一半,因而,引物设计一直都是PCR非常重要的环节。PrimerPremier5和Oligo7这两款软件想必是备受科研汪们推崇的引物设计软件。可是对于懒癌晚期的小鱼而言,下载这两款软件也是一件非常麻烦的事情。有木有比这两款软件更简单粗暴的引物获取方法呢?在这里小鱼特地给大家推荐3款简单实用的在线PCR引物设计软件,让你分分钟搞定PCR引物。

No.1 :NCBI的Primer-Blast

推荐指数:五颗星

理由:这个工具整合了目前流行的Primer3软件,且加上NCBI的Blast进行引物特异性的验证;可以针对某一特定剪接变异体基因来设计引物。

网址链接:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/或者直接从Blast主页(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)上找到。

Primer-Blast的界面包括4个部分:PCRTemplate(模板区),Primer Parameters(引物区),Exon/intron Selection(外显子内含子设置)和specificity check(特异性验证区)。

1、设计引物

PCR引物设计,3款在线软件就能搞定!

2、验证引物好坏

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3、外显子内含子(Exon/intron)

如果设计的引物是跨内含子和外显子的交界处,可在此处设置成为Primer must span an exon-exon junction。外显子的匹配碱基数和内含子的长度等设置一般选择默认。

PCR引物设计,3款在线软件就能搞定!

4、特异性(Specificitycheck)

在specificity check区,选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这一步是比较重要的。

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这里提供了7种数据库:

RefSeq mRNA,Genome (referenceassemblies from selected organisms),RefSeqrepresentative genomes,RefSeq RNA(refseq_rna),nr (the standard non-redundant database),Genome (chromosomesfrom all organisms)和custom。

前两个数据库是经过专家注释的数据,这样可以给出更准确的结果。特别是,当你用NCBI的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标准来设计引物时,Primer-BLAST可以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。

最后建议用oligo6或primer5验证引物自身的特性:发夹结构、引物自身二聚体、错配和引物间二聚体,△G的绝对值。

No.2 :Primer3 Plus

推荐指数:五颗星

理由:严格的qPCR引物设计一般要求其中一条引物要跨外显子,最好在3‘端设计引物,产物的长度在300bp以内等。本在线软件可满足qPCR引物设计的要求。

网址链接:http://www.primer3plus.com/

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1、选择Run latest Versionof Primer3Plus,就进入了设计引物的主页面,合理的使用<>,[],{}符号使引物设计符合自己的要求,大家可以在具体实战中,深入体会这几个符号带来的方便。

PCR引物设计,3款在线软件就能搞定!

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2、避免多个重复碱基出现,避免4个或超过4个G出现在引物序列中。按照荧光定量引物要求设置参数,如产物长度:不应该超过400bp,最好100-150bp;GC%:30%-70%,最好45%-55%;引物长度:18-25bp,最好22-24bp;TM值:58-60℃,最好60℃;3’端:3’端至少4个碱基保守,最好为T,C,G。

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3、点击右上放绿色按钮

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,可获得若干对引物,并按照5’到3’的顺序,包含了引物和产物的一些基本参数。可以根据荧光定量引物要求,尽量选择G、C结尾的引物合成,如下图中红框所示,还可以在序列图中看到引物的位置。

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4、设计好引物后,我们要进行NCBI blast 引物验证,进入http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

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5、点击Basic BLAST中的nucleotideblast选项,在下面框中,按照5’-3’顺序,分别输入上游引物和下游引物,上下游引物之间间隔20个以上n。

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6、选择物种数据库,如Human,Mouse或者Others(如果是非人和非小鼠物种)。

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7、选择Somewhat similar sequences(blastn)

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8、点击Algorithm parameters, 在Expect threshold 输入1000,在Word Size 输入7。Word size不是字体大小的意思,应该理解为读长,按照7个一组核苷酸序列放到GeneBank中进行比对。

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9、点击BLAST,开始比对,出现结果。颜色代表得分,选择引物的原则是:列表中大部分是目的基因,说明引物特异性高;但是可能物种不同,说明该基因在不同物种中保守。

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No.3 :Primerbank

推荐指数:五颗星

理由:哈佛大学的一个qPCR引物数据库,目前有超过20万条引物,涵盖了人和小鼠大部分已知的基因。根据网站上对两万多对引物的验证结果,引物有效率为82.7%。尽量选择这种验证过的qPCR引物,qPCR品质比较有保障。

网址:http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/

PCR引物设计,3款在线软件就能搞定!

搜索类型这里,可以根据GenBank accession、NCBI protein accession、NCBI gene ID、primerbank ID、NCBI gene symbol以及keyword六个选项进行搜索。以小鼠的beta-actin为例。

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1、首先,到NCBI上找出β-actin的gene ID,如图,选择gene,输入beta-actin:

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点击右边的分类musmusculus:

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结果就出来了,小鼠beta-actin的NCBI gene ID是11461,而actb则是小鼠beta-actin的NCBI gene symbol。

2、把11461输入到primerbank里面试试:

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在这个结果上我们可以看到beta-actin的NCBI gene ID、GenBank accession、NCBI protein accession、coding DNA length等信息。

3、若是改输入beta-actin的NCBI gene symbol:actb,也可以得到相同的结果,往下拉我们还能看到经过验证的引物:

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4、点进去可以看到溶解曲线、电泳结果等信息:

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